人高转移性肝癌细胞MHCC97H/LUC培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：人高转移性肝癌细胞MHCC97H/LUC
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）
培养体系：DMEM + 10% FBS + 1% P
传代方法：首次传代建议比例为1:2，传代情况每2天更换培养液。
备注：使用无菌离心管收集培养基，以便进行对照实验。如对比培养结果不理想，建议直接使用尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

在细胞稳定后，可将其灌满完全培养液并封闭瓶口，以确保细胞的健康运输。收到细胞后，应首先用75%酒精对细胞瓶进行消毒，然后在超净工作台内开展无菌操作。在37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态。建议显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍率的照片（最好包括40x、100x及200x各一张），前三天的照片将成为重要的售后依据，未提供照片将默认为状态良好。（建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自行配制的完全培养基进行对比培养，并在换液后将瓶盖稍微拧松）

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞汇合度未达到80%，应将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱中培养。若细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况。如细胞大部分变圆并脱落，应迅速回到操作台，轻敲培养瓶后添加超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落，吸出悬液并转移至15ml离心管中，1000RPM下离心5分钟，弃去上清液后补加1-2ml的完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞完全覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次；
2. 向培养瓶中添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，并轻轻吹打使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；
3. 弃去上清液，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），充分混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接置于-80℃冰箱保存，如需转移至液氮罐，则需在-80℃冰箱中保存24小时以上后再进行转移。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管内，1000rpm离心5分钟；
3. 弃去上清液，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养；
4. 次日更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，细胞有时会因贴壁不牢而脱落，这是正常现象。如细胞脱落较多，建议将培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后期可作对比培养），沉淀后加入1-2ml胰酶轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，再离心、弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
1. 细胞运输途中的各种问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，均可重发；
2. 细胞污染问题需在收到产品48小时内提交真实的实验结果，经核实后可重发；
3. 常温发货的细胞静置24小时后或干冰冻存的细胞复苏后24小时内大部分细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可重发；
4. 如果干冰发货的细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时后未开封出现污染，亦可重发；
5. 细胞活性问题要求在收到产品7天内提供真实的实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予以重发；
6. 收到细胞当天及第2、3天需拍照留存，3天内未告知的视为产品合格。如果在4-7天内出现问题，需提供收到细胞前三天的照片及出现问题时的照片，并详细记录细胞相关操作的步骤，经技术人员确认后，符合我方责任的予以重发。若技术人员判定责任由双方承担，则需协商处理，或按合同价的50%收费重发。

2）细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
1. 客户造成的细胞污染，不予重发；
2. 客户因不当操作导致细胞状态不佳，不予重发；
3. 使用非本库推荐的细胞培养体系所致的细胞状态不佳，不予重发；
4. 细胞状态不佳且未提供前三天照片的，不予重发；
5. 细胞培养时经过其它处理的，不予重发；
6. 收到后2天内未告知的，不予重发；
7. 具体情况视而定。