在生物医疗领域，当科研同仁谈论他们珍贵的RNA样品时，我们经常听到“请将试管放在冰上！”和“希望它不会降解”。RNA的本质使其比分子生物学研究中使用的多数大分子（如DNA或蛋白质）更不稳定。因此，在CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）同样面临“易碎”的挑战。为了解决这个问题，近期研究表明，通过化学修饰，gRNA能够抵抗降解，同时保持引导Cas9进行靶向切割的有效功能。这些gRNA技术的进步增强了靶向效果，并减轻了对RNA状态的不必要担忧。

一些gRNA的修饰不仅提升了其稳定性，还增加了功能多样性，有些甚至能够改变“开关”的状态。稳定的gRNA修饰主要集中在磷酸糖骨架上，由约20个核苷酸构成的gRNA引导CRISPR/Cas9靶向识别序列。除了20个核苷酸的引导序列外，crRNA的3'末端还含有一个约20个核苷酸的重复区，这与Cas9蛋白的转激活RNA（tracrRNA）相互作用。这些RNA分子容易受到细胞质及核酸酶的攻击，因此需要特别措施来保护它们免受降解。

自然界早已进化出防止重要细胞RNA分子降解的方法，其中一种常见的防护方式是2'-O-甲基化，甲基被添加到核糖的2'羟基上，能够有效抵御溶核攻击。另一个在相同位置发现的稳定修饰是2'-氟（2'-F），它是用氟代替了羟基。而在糖环中，一种流行的稳定修饰是3'-硫代磷酸酯键，其中硫取代了非桥接的磷酸氧。其他有用的骨架修饰选项包括酰胺键、解锁核酸和限制性乙基。

那么，哪种RNA骨架修饰效果最佳呢？研究表明，将几种修饰组合使用，如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰的组合，通常比单一修饰更为稳定。这些修饰可以通过市售试剂盒在实验室中完成，或者在购买gRNA时作为合成修饰进行订购。修饰通常用于crRNA分子的末端（通常是前3个核苷酸之一至三个进行修饰），以保证最佳的稳定性和有效性。

除了以上提到的修饰，脱氧核糖核酸（DNA）也是一种更为稳定的选择。在预算允许的情况下，通过简单地将几种核糖核苷酸替换成脱氧核苷酸，可以提高gRNA的效率。含有部分DNA的gRNA对Cas9蛋白的耐受性极佳，并能够提升靶向效率。此外，锁定核酸或桥接核酸的引入也能够增强gRNA的稳定性和核酸酶抗性，从而减少脱靶事件。

在CRISPR/Cas9的研究中，一些RNA稳定修饰技术源于以往的siRNA和反义寡核苷酸应用。尤其是那些不含5'-三磷酸盐的合成修饰，能够显著降低与gRNA相关的先天免疫反应，这在引入外源RNA时尤其重要，可能会影响细胞的活力或实验结果。

目前，gRNA修饰的研究进展使得可光激活和可光切割的gRNA技术得以开发，通过在gRNA的20nt靶向区域引入特定的接头，用光照来有效控制gRNA的状态。这些gRNA在适当光源下暴露不到一分钟即会失活，确保实验的准确性和控制性。

此外，通过对gRNA进行荧光染料标记，研究人员可以可视化转染效率，甚至在细胞实验中追踪其定位。市面上有多种适合的荧光染料供选择，用户可选择自行使用试剂盒或购买带标签的合成染料。

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